defgf24uw
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 Wysłany: Pon 18:43, 28 Lut 2011 Temat postu: ghd deutschland PTA1酵母双& |
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PTA1酵母双杂交载体的构建
tKS(一)载体连接，转化DH5o：，筛选得到含有插入片段的阳性克隆，小量法提质粒后，用EcoRI／BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图l—C)。测序结果表明，序列正确(测序结果略)2．TA1各片段由oBluescd~KS(一J向pLexA的亚克隆将含有插入片段的pBluescriptKS(一)载体用EcoRi／BamHI双酶切后．回收切下的PTAI片段,[link widoczny dla zalogowanych]，与同样双酶切的pLexA载体连接，转化DH5c~，筛选得到含有插入片段的阳性克隆。小量法提质粒后，用EcoRI／BamHI双酶切，可切下相应大小的片段(图1一B】。3论酵母双杂交技术是90年代兴起的一种研究蛋白质之间相互作用的新技术“。依据真核转录因子的DNA结构域与活化域分离的特性，将靶蛋白和钓饵蛋白分别与二者结合。只有靶蛋白与钓饵蛋白可相互作用时，转录因子所调控的报告基因才能表达,[link widoczny dla zalogowanych]。所以依据报告基因表达与否，即可判断靶蛋白与钓饵蛋白之问是否作用。采用这种技术，不但可以验证已知蛋白之间的相互作用，也可以通过筛选靶蛋白表达文库来寻找与靶蛋白结台的新的蛋白。所以应用酵母双杂交技术，对寻找PTA1的配体及其信号转导蛋白是一条新的技术路线。FFA1的胞膜外区由两个Ig样结构域组成，目前还没有任何证据表明，是哪一个结构域与配体结合，也许两个结构域均可与配体结合，或者两个结构域分别与不同的配体结合所以在设计双杂交载体时，应将PTAI胞膜外区两个结构域分别及全部克隆人表达载体,[link widoczny dla zalogowanych]。这样，如果筛选到阳性结果，将可同时了解到与该配体结合的结构域。酵母属真核细胞，相对于原核细胞的表达而言，其表达产物更接近于天然。我们采用Clontech公司的blACTH—MAKERLexA酵母双杂交系统,[link widoczny dla zalogowanych]，蛋白表达量高，具有双重报告基因，因而敏感性更高。但其与其它蛋白表达系统一样，酵母中蛋白的表达也具有一定的不确定性,[link widoczny dla zalogowanych]，只有待所构建的载体在酵母中转化并表达后，才能确定所插入的片段是否正确表达。
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